中醫認為腫瘤的發生與邪正盛衰，陰陽氣血津 液失調等因素密切相關，正氣不足是腫瘤發生的前 提條件，邪氣距之是腫瘤發生的重要原因，針對腫 瘤患者的臨床表現，顧及手術、放化療對人體的損 害，我院臨床醫生提出以扶正和祛邪為兩大基本原則，總結出以太子參、茯苓、陳皮、甘草等 12 味中藥 組成的協定處方“扶正方”。

1 材料

1． 1 儀器

Ultimate 3000 HPLC 高效液相色譜儀 ( 美國 Thermo Fisher Scientific 公司) ; Q-Exactive Orbitrap /MS 四級桿軌道阱質譜( 美國 Thermo Fisher Scientific 公司) ; Compound Discovereru 處理軟件( 美 國 Thermo Fisher Scientific 公司) ; SIMCA-P 13． 0 多 元統計分析軟件( 瑞典 Umetrics 公司) ; Anke TGL16B 離心機( 上海安亭科學儀器公司) ; BSA224S 電 子天平( 德國 Sartorius 公司) ; 昆山舒美KQ-500B 型超聲波清 洗器( 昆山市超聲儀器有限公司) 。

1． 2 試藥

乙 腈、甲 醇、超 純 水( 德 國 Merck 公 司) ; 甲酸、L-2-氯苯丙胺酸( 美國 Sigma-Aldrich 公 司) 。收集“扶正方”傳統中藥飲片( 蘇州天靈中藥 飲片有限公司，批號 190120010) 和配方顆粒( 江陰 天江藥業有限公司，批號 18120411) 樣品各 5 份。 所有樣品均由南京中醫藥大學藥學院劉訓紅教授鑒定為各自種屬藥材，留樣憑證保存于江南大學附 屬醫院( 無錫市第四人民醫院) 中藥房。

2 方法

2． 1 供試品溶液的制備

傳統扶正方中藥飲片: 按扶正方配伍量( 太子參、茯苓、南沙參、北沙參、麥 冬、天花粉、生白術、生黃精、酒女貞子、淫羊藿均為 10 g、陳皮 6 g、甘草 3 g) ，精密稱取飲片，加 8 倍量 的蒸餾水浸泡 30 min，武火煮沸后改文火再煎 20 min，趁熱濾出藥液，藥渣再加相當藥材量 6 倍量的 蒸餾水，煮沸后文火再煎煮 30 min，濾過，合并濾液， 蒸干。殘渣加入 800 μL 甲醇和 10 μL 內標( 2． 8 mg ·mL － 1，二氯苯丙氨酸) ，置于組織研磨儀中 65 Hz 研磨 90 s，隨后 40 kHz 冰浴超聲 30 min，在 － 20 ℃ 下靜置1 h，以12 000 r·min － 1離心15 min( 置于4 ℃ 離心機中) ，取上清液，過 0． 22 μm 微孔濾膜，即得。 扶正方配方顆粒: 按扶正方配伍量( 太子參 1． 5 g、茯苓 1 g、陳皮 1 g、南沙參 2 g、北沙參 2 g、麥冬 3 g、天花粉 1 g、甘草 0． 5 g、生白術 3 g、生黃精 4 g、酒 女貞子 1 g、淫羊藿 0． 5 g) ，精密稱取各配方顆粒，混 合均勻，加適量沸水溶解后稀釋至與傳統扶正方中 藥飲片水煎液相同體積，之后制備方法同上。

2． 2 測定條件

色譜條件: 色譜柱: Hyper gold C18 色譜柱( 100 mm × 2． 1 mm × 1． 9 μm) ; 流動相: 水 + 5% 乙腈 + 0． 1% 甲酸( A) 和乙腈 + 0． 1% 甲酸( B) ; 梯度洗脫程序: 0 ～ 1． 5 min( 100% ～ 80% A) ，1． 5 ～ 9． 5 min( 80% ～ 0% A) ，9． 5 ～ 14． 5( 0% ～ 0% A) ， 14． 5 ～ 14． 6 ( 0% ～ 100% A) ，14． 6 ～ 18 ( 100% ～ 100% A) ; 流速 0． 35 mL·min － 1 ; 柱溫 40 ℃ ; 進樣量 10 μL。 質譜條件 電噴霧離子源( ESI) ，在正離子模式 下數據采集范圍 m / z 50 ～ 1 000，加熱器溫度 300 ℃ ; 鞘氣流速: 45 arb; 輔助氣流速: 15 arb; 尾氣流 速: 1 arb; 電噴霧電壓: 3． 0 kV; 毛細管溫度: 350 ℃ ; S-Lens ＲF Level，30% 。在負離子模式下數據采集 范圍 m / z 50 ～ 1 100，加熱器溫度 300 ℃ ; 鞘氣流速: 45 arb; 輔助氣流速: 15 arb; 尾氣流速: 1 arb; 電噴霧 電 壓: 3． 2 kV; 毛 細 管 溫 度: 350 ℃ ; S-Lens ＲF Level，60% 。

2． 3 數據處理與統計分析

采用 Compound Discoverer 軟件對 LC /MS 檢測數據進行提取和預處理， 并在 Excel 2010 中對數據進行歸一化及后期編輯， 最后整理成二維數據矩陣形式，包含保留時間、分 子量、峰強度等信息。將編輯后的數據矩陣導入 SIMCA-P 13． 0 軟件進行多元統計分析。采用 PCA分析通過初步觀察各樣品的聚集情況，直觀地表達 不同劑型扶正方之間的化學組成差異; 隨后采用 PLS-DA 和 OPLS-DA 進一步對樣品進行分類，其中 判別模型質量好壞的主要參數為 Ｒ2 Y( 該值為模型 的解釋率) 及 Q2 值( 該值為模型的預測率) ，Ｒ2 Y 越 接近 1，表示模型越穩定，Q2 ＞ 0． 5 表示預測率高。 根據 OPLS-DA 模型的常用變量載荷評價參數 ( VIP) ( VIP ＞ 1) ，并結合 t-test 的 P 值( P ＜ 0． 05) 來 尋找差異性表達代謝物。

3 結果

采用的 PCA 多變量模式識別方 法對傳統中藥飲片和配方顆粒扶正方進行降維分 析。不同劑型扶正方在質譜正、負離子模式下 PCA 得分散點圖，見圖 2 ( 正離子模式下，Ｒ2 X = 0． 824， Q2 = 0． 633; 負離子模式下，Ｒ2 X = 0． 811，Q2 = 0． 661) 。結果顯示在正、負離子模式下，不同劑型扶 正方之間均具有很好的區分度，這表明傳統中藥飲 片和配方顆粒扶正方的化學成分存在明顯差異。通過排列試驗隨機多次( n = 200) 改變分 類變量 y 的排列順序得到相應不同的隨機。從圖 3b 和 3d 可見，PLS-DA 模型排列實驗中左端隨機排 列產生的 Ｒ2 和 Q2 值均小于右端的原始值，表明原 始模型的預測能力大于隨機排列 y 變量的預測能 力，即模型有效，可以進行后續的差異成分分析。

4 討論

本實驗供試品溶液制備分別考察了 100% 甲醇、 70%甲醇、50% 甲醇、30% 甲醇 4 種溶劑對實驗結果 的影響，同時考察了 15，30，45，60，75 min 超聲提取時 間，結果表明，以100%甲醇作為溶劑的色譜峰形最優 且超聲提取 30 min 的相對峰面積最大。因此，最終 選擇這種樣品處理方法。流動相的選擇分別考察了 甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0． 1% 甲酸水、乙腈-0． 1% 甲酸水、乙腈 + 0． 1% 甲酸水-乙腈 + 0． 1% 甲酸、5% 乙 腈 + 0． 1%甲酸水-乙腈 + 0． 1% 甲酸，結果表明 5% 乙 腈 + 0． 1%甲酸水-乙腈 + 0． 1% 甲酸的峰形較好且分 離度較高，因此將其確定為流動相。



 

免責聲明：文章僅供學習和交流，如涉及作品版權問題需要我方刪除，請聯系我們，我們會在第一時間進行處理。